NEB DNA連接酶

-重組T4 DNA連接酶、T4快速連接酶、T7 DNA連接酶

北京云肽生物科技代理的美國進口NEB DNA連接酶，包括T4 DNA連接酶、T4 DNA快速連接酶試劑盒、T7 DNA連接酶、電轉連接酶等，覆蓋平末端連接酶、T/A連接酶、無縫克隆連接酶、快速連接酶等廣泛類型，為生命科學實驗中分子克隆相關應用提供豐富、高效的連接酶選擇。

NEBT4DNA 連接酶作為NEB優勢產品，連接效率高、穩定性強，滿足傳統酶切克隆、Golden Gate組裝無縫克陸、TA克隆在內的各類克隆需求，成為DNA連接酶的理想選擇。

①高性能--NEBT4 連接酶可實現10min連接粘性末端、2h連接平末端(或高濃度連接酶10min連接平末端)、5min快速連接粘性末端或平末端等，連接性能非常高效。

②種類豐富--NEB針對不同實驗需求進行配方優化，提供耐鹽、耐熱、電轉連接酶等多種類型，以應對復雜實驗需求。

③質控嚴格--NEB DNA 連接酶具備非常高的酶純度、連接活性高、無其他酶干擾、質控嚴格，產品質量報告COA除提供連接酶活性、SDS-PAGE純度外，更對內切酶、外切酶活性進行驗證，保證產品質量高水準。

1、NEB T4 DNA連接酶

NEBT4 DNA連接酶(T4 DNA Ligase，貨號M0202)，是重組連接酶，可連接平末端、粘性末端，還可修補雙鏈DNA和部分DNA/RNA雜交鏈中的單鏈切刻位點，適用于高復雜性文庫克隆。室溫(20~25℃)條件下，連接粘性末端，在20pl反應體系中加入1μL T4 DNA連接酶，反應2h，或者加入1μL高濃度的T4 DNA連接酶反應10min?？商峁〨MP級別產品。

2、NEB快速連接試劑盒

NEB快速連接試劑盒(Quick Ligation Kit，貨號M2200)，作為快速T4連接酶，對反應體系進行優化，在室溫條件下(25℃)，可在5min內連接粘件末端或平末端DNA片段，時間過長并不會提高連接效率。

圖.時間連接進程。LITMUS 28i載體經EcoRV(平末端)或Hindlll(粘性末端)切割后，用小牛腸磷酸酶進行處理和凝膠純化。使用NEB快速連接試劑盒將Haelll消化后的中X174DNA插入片段(平末端)和Hind!消化后的入 DNA播入片段(粘性末端)連按到各自的載體中，播入片段與載體的比例3:1。將連接產物轉化到化學感受態大腸桿菌DH-5a細胞中，并在37*C條件下LB-amp平板上過夜培養。

3、NEB平末端/TA連接酶預混液

NEB平末端/TA連接酶預混液(Blunt/TALigase MasterMix，貨號M0367)，即用型2x預混液，內含T4 DNA 連接酶、連接增強劑和經優化的反應緩沖液，專為提高平末端和單堿基突出末端的連接效率和轉化效率而設計。

圖.平末端/TA連接酶預混液提高了反應通常較慢的末端連接的產量。在所有反應條件下，使用高濃磨T4 DNA 連接酶、快速連接試劑盒、平末端/TA預混液的最終連接產物產量。切刻位點、粘性末端和3'單堿基突出末端的底物溫育15min進行連接；5’單堿基突出末端的底物溫育1h進行連接。

4、NEB瞬時粘性未端連接酶預混液

NEB瞬時粘性末端連按酶預混液(instant sticky-end Ligase Master Mix，貨號M0370)，即用型2x預混液，內含T4DNA連核酶、連接增強劑，優化了酶和緩沖液組分的比例，專為照時連接粘性未端(2~4bp)和提高轉化率設計。當DNA量少且濃度較低時，仍可進行亞克隆連接，節省寶貴的DNA樣本，并且無需稀釋，可直接轉化到多種化學感受態大腸桿菌菌株中。

5、NEB電轉連接酶

NBE電轉連接酶(ElectroLigase，貨號M0369)，由T4DNA連接酶和經優化的即用型2x反應緩沖液組成，內含連接增強劑，不含PEG，專業用于促進各種DNA末端(平末端、粘性末端、TA末端)的高效連接和電轉化，可在低DNA濃度的小體系中進行亞克隆連接，節省寶貴的DNA樣品，無需純化或稀釋，反應液可直接轉化到多種電轉感受態大腸桿菌菌株中，也可用于化學感受態大腸桿菌菌株。

圖.使用電轉連接酶建立連接反應體系，內含等量的(20ng載體和3倍摩爾量的插入片段)平末端(A)、T/A(B)或粘性末端(C)載體/插入片段，并溫育如圖所示的相應時間。熱失活后，每個反應取2μL直核轉化到NEB 10-beta 電轉感受態大腸桿菌中。取50μL的復蘇菌液(某些情況下需要稀釋)涂到選擇性培養板上，37℃溫育過夜。最后統計菌落。

6、NEB Hi-T4 耐熱DNA連接酶

NEB Hi-T4耐熱DNA連接酶(Hi-T4 DNA Ligase，貨號M2622)，是經基因工程改造的T4 DNA連接酶的變體，改善了熱穩定性，可在高達50℃條件下連按平末端和粘性末端，還可修補雙鏈DNA、RNA和一些DNA/RNA雜交鏈中的單鏈切刻。

圖.Hi-T4耐熱DNA連接酶的耐熱性優于T4 DNA 連接酶。400單位T4 DNA 連接酶或Hi-T4耐熱DNA連接酶在無DNA底物的1xT4 DNA 連接酶緩沖液中，以45℃預溫育指定時長。加入0.12μM  Hindlll(粘性末端)熒光標記片段，并以37℃溫育15min，測試連接酶的剩余活性。連接產物經毛細管電泳分析。T4 DNA 連接酶在45°C時逐漸失去活性，而Hi-T4耐熱DNA連接酶即使在45°C溫育72h后在連接粘性末端底物上仍保持完整活性。

圖.Hi-T4耐熱DNA連接酶對更高溫度循環的耐受性優于T4 DNA連接酶。在1 X T4DNA 連接酶緩沖液中，分別用1000單位T4 DNA連接酶或Hi-T4耐熱DNA連接酶與DNA(1μg PBR322)進行循環溫浴。循環溫度設置為:42℃(A)或50℃(B)5min，16℃5min。在指定的循環次數(0、15、30、45或60次)之后.以熒光標記的粘性末端底物(Hindlll突出末端，25℃時10min)檢測連接酶活性。連接產物經毛細管電泳分析。顯示了連接酶的利余活性(相對于0循環數劇點)。

A:在16℃和42℃條件下，T4 DNA連接酶經過循環后逐漸失去活性(金黃線)，而Hi-T4耐熱DNA連接酶在此溫度條件下經過60次循環后仍保持活性(橙紅線)。

B:在16℃和50℃的15次循環后，T4 DNA連接酶wan全失去活性(金黃線)，而Hi-T4耐熱DNA連接酶在此溫度條件下經過60次循環后仍保持約60%的活性(橙紅線)

7、NEB Salt-T4 耐鹽DNA連接酶

NEB Salt-T4耐鹽DNA連接酶(Salt T4 DNA Liase:貨號MO467)，是經基因工程改造的T4 DNA連接酶的變體，具備更強的耐鹽性，反應體系中高達300mM的鹽濃度不影響連接酶活性。該酶不僅能夠連接平末端和粘性末端，還可修補雙鏈DNA和一些DNA/RNA雜交鏈中的單鏈切刻。

圖.與T4 DNA連接酶相比，Salt-T4耐鹽DNA連接酶對粘性末端底物表現出更高的耐鹽性。取400單位的T4 DNA連接酶或Salt-T4耐鹽DNA連接酶與0.12μM熒光標記的Hindlll酶切片段(粘性末端)，在鹽量梯度(0~1000mM NaCL)的1 X T4 DNA連接酶緩沖液中25℃溫育10min。連接產物經毛細管電泳分析。當鹽濃度超過200mM時，T4 DNA連接酶的活性迅速喪失;當鹽濃度高達500mM時，Salt-T4耐鹽DNA連接酶連接粘性末端底物時仍保留>60%的活性。

8、NEB T3 DNA 連接酶

NEB T3 DNA連接酶(T3 DNA Ligase，貨號M0317)，來源于T3噬菌體，是一種ATP依賴型雙鏈DNA連接酶，對NaCL的耐鹽性是T4 DNA 連接酶的2倍，可用于粘性末端、平末端、切刻位點的連接，與T4 DNA 連接酶一樣，在反應中加入PEG 6000 可以提高平末端連接效率。

9、NEB T7 DNA 連接酶

NEBT7 DNA連接酶(T7 DNA Ligase，貨號M0318)，來源于T7噬菌體，是一種ATP依賴型雙鏈DNA連接酶，僅可連接粘性末端，不能連接平末端，適用于當DNA平末端和粘性末端同時存在，而僅需連接粘性末端時。

圖.T7 DNA 連接酶不會連接平末端DNA片段。每種底物取200ng，每種連接酶取1μl，建立包含平末端片段(ФX174 DNA-Haelll Digest)和粘性末端片段(λDNA-Hindlll Digest)的連接反應體系，并在相應的反應緩沖液中以25℃溫育30min。添加6×上樣染料立即終止反應，然后通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，再利用溴化乙錠進行染色。

10、NEB Taq 高保真DNA連接酶

NEBTaq高保真DNA連接酶(HiFi Taq DNA Ligase，貨號M0647)，由熱穩定DNA連接酶和添加劑組成，在高溫(37~75℃)范圍內具有活性，多次熱循環后仍保持活性，能以非常高的保真度高效連接DNA切刻，適用于依賴連接酶的IVD技術(如連接酶鏈反應LCR、連接酶檢測反應LDR)，可降低錯配連接。

11、NEBridge連接酶預混液

NEBridge連接酶預混液(NEBridge Ligase Master Mix，貨號M1100)，專用于Golden Gate無縫克隆，作為即用型3x預混液，含有T4 DNA 連接酶和連接增強劑，可與多種NEBIIS型限制性內切酶搭配使用，進行高效率、高保真的Golden Gate 組裝，支持在單個反應中同時進行2~52個片段的組裝，可用于單片段克降和文庫構建。

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