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蔗糖磷酸化酶(Sucrose Phosphorylase, SP)試劑盒說明書

更新時間:2025-01-11      瀏覽次數:879


蔗糖磷酸化酶(Sucrose Phosphorylase, SP試劑盒說明書

分光光度法 50 /48 

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義:

SP(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中,裂解葡萄糖苷鍵,催化葡萄糖基轉移到果糖、木糖、半乳糖和鼠李糖等,合成相應的葡萄糖基低聚糖。此外,SP 還能催化氫醌合成熊果苷,具有ji強的美白效果,在化妝品工業中具有重要應用。

測定原理:

SP 能夠以磷酸為受體,催化蔗糖產生 1-磷酸葡萄糖,在葡萄糖磷酸變位酶催化下變位為 6-磷酸葡萄糖,在 6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下還原NADP+生成NADPH,導致 340nm 光吸收值增加。測定 340nm 光度增加速率,即可計算SP 活性。

組成:

 

產品名稱

BF6017-50T/48S

Storage

提取液:液體

50ml

4℃

試劑一:液體

35ml

4℃

試劑二:粉劑

1

-20℃避光

試劑三:粉劑

1

-20℃避光

說明書

一份

 

試劑二:粉劑×1 瓶,-20℃避光保存,臨用前加 6ml 蒸餾水溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

試劑三:粉劑×1 瓶,-20℃避光保存,臨用前加 12ml 蒸餾水水溶解;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。

 

自備儀器和用品:

天平、低溫離心機、恒溫水浴鍋、紫外分光光度計、1 ml 石英比色皿和蒸餾水。

粗酶液提取:

1. 組織:按照組織質量(g):提取液體積(ml) 15~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1ml 提取液)進行冰浴勻漿,然后 10000g4℃,離心 10min,取上清待測。

2. 細菌、真菌:按照細胞數量(104 個):提取液體積(ml 500~10001 的比例(建議 500 萬細胞加 1ml 提取液,冰浴超聲波破碎細胞功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時間 3min);然后 10000g 4℃,離心 10min,取上清置于冰上待測。

測定步驟:

1. 分光光度計預熱 30min,調節波長至 340nm,蒸餾水調零。

2. 操作表

試劑名稱

對照管

測定管

試劑一μl

600

600

試劑二μl

100

100

試劑三μl

200

200

樣本μl


100

蒸餾水μl

100


迅速混勻,于 1ml 石英比色皿,37℃下測定 340nm 的初始吸光值與反應 2min 后的吸光

值,測定管記作A1 A2,對照管記作A3 A4A=A2- A1-A4- A3

SP 活性計算公式:

1. 按照蛋白濃度計算

酶活定義:37℃pH6.8 時,每毫克蛋白質每分鐘催化產生 1nmol NADPH 為一個酶活單位。


SP 活性(nmol/min/mg prot=

2. 按照樣本質量計算

DA

e d

×V 反總÷V ÷Cpr÷T=804×A÷Cpr


酶活定義:37℃pH6.8 時,每克樣本每分鐘催化產生 1nmol NADPH 為一個酶活單位。


SP 活性(nmol/min/g 鮮重=

3. 按照細胞數量計算

DA

e d

×V 反總÷(V ÷V 樣總×W)÷T=804×A÷W


酶活定義:37℃pH6.8 時,每 104 個細胞每分鐘催化產生 1nmol NADPH 為一個酶活單位。


SP 活性(nmol/min/104 cell=

DA

e d

×V 反總÷(V ÷V 樣總×細胞數量(萬個))÷T=804×細胞數量(


eNADPH 摩爾消光系數,6220 L/mol/cmd:比色皿光徑,1cmV 反總:反應體系總體積,1mlV 樣:反應體系中樣本體積,0.1mlW:樣本質量,gCpr:蛋白濃度,mg/mlV 樣總:加入提取液體積, 1mlT:反應時間,2min

注意事項:

1. 可選用BCA 法測定蛋白含量試劑盒測定蛋白含量。

2. 樣本較多時,可以按照每個樣本試劑一:試劑二:試劑三=600100200μl)的比例配制工作液,用多少配多少,臨用前立刻配制,10 分鐘內使用。


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